RituximabのLNに対するRCT、LUNAR試験は失敗に終わったと理解していますが、その後のPost hoc解析で、面白いことが分かったようです。
Peripheral Blood B Cell Depletion after Rituximab and Complete Response in Lupus Nephritis.
Gomez Mendez LM, Cascino MD, Garg J, Katsumoto TR, Brakeman P, Dall'Era M, Looney RJ, Rovin B, Dragone L, Brunetta P.
Clin J Am Soc Nephrol. 2018 Oct 8;13(10):1502-1509.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30089664/
Introduction
ループス腎炎(LN)では、糸球体に免疫複合体が蓄積され、補体が活性化され、炎症反応が開始される[1,2]。ケモカインに誘引されたB細胞は血液循環から腎臓に移動し[3]、尿細管間質で集簇する[4,5]。これらのリンパ球の集合体は、高B細胞活性化因子（BAFF）の環境を醸成し、B細胞は局所抗原に応答してクローン拡大やsomatic hypermutationを起こす[4-6]。このプロセスは、間質の炎症とダメージのサイクルを永続させ、その程度は腎不全への進行と関連する[7]。B細胞をターゲットとした治療は、血清中の免疫複合体や腎臓のリンパ球集簇塊を減少させることにより組織ダメージを抑制する可能性があり、LNに使用することが魅力的である[8,9]。リツキシマブ（RTX）は、CD20+ B細胞を除去するキメラ型抗CD20 monoclonal Abである。LNにおいてRTXを評価した試験、LUNAR試験はLNの治療に対するRTXの最大のRCTであったが、末梢血中のB細胞を目標値の20個/mlまで減少させたにもかかわらず、RTXの有効性を高めることはできなかった[10]。LNのmodel mouseやSLE患者におけるRTXの効果をさらに検討した結果、RTXは末梢血B細胞の完全あるいは長期の減少を必ずしも全例でもたらしていないこと、リンパ組織B細胞の減少も不完全であることが明らかになった[11-21]。不完全な末梢血B細胞の減少は、SLE患者におけるRTXに対する反応性の欠如と関連しており[20]、末梢血や腎尿細管における不完全なB cell depletionの欠如は、LNにおけるRTXの効果を減弱する可能性があると仮定される[22]。LUNAR試験は、B cell depletionの動態をしたするまたとない機会を提供しうる。LUNARの参加者は、RTX投与後の末梢血B細胞減少の程度と期間にばらつきがあり、これらの末梢血B細胞減少の指標は、complete responseの達成率の上昇に関連するという仮説を設定した。
Materials and Methods Participants and Setting
LUNAR試験（Clinicaltrials.gov ID NCT00282347、登録日2006/1/24）[10]には、2006.1月~2009.1月までUSAとLatin Americaの52施設からLN患者144人が登録された。参加者は16-75歳で、ACR基準に基づくSLEの診断を受け、ANA陽性の既往があり、腎生検で確認されたLN class III or IV（単独またはclass Vの合併）とUPCR >1が条件とされた。生検でglomerular sclerosisが＞50％の患者、eGFRが<25ml/分の患者は除外。参加者は、RTX（n=72）、placebo（n=72）に無作為に割り付けられた。RTXを投与された参加者のみが評価され、誤ってRTXを投与されたplacebo群の参加者1名も含んだ。少なくとも300日間のCD19測定が完了していない5例を除外し、合計6例を解析対象とした。LUNAR試験プロトコルは、IRBの承認を受け、Helsinki宣言に準拠した。参加者は書面で同意した。
Treatment Protocol
治療protocolの参加者は、1、15、168、182日目にRTX1gを投与された。MMFは3g/日で維持された。1日目と3日目にmPSL 1gを投与された。参加者は15、168、182日目にRTX前にmPSL100mgを投与された。経口PSNは、Aspreva Lupus Management Study試験（23）と同様に、1日0.75 mg/kgから開始し、16週目までに10 mg/dに漸減された。参加者は合計 78 週間追跡された。
B Cell Measurements
ルーチンの4色フローサイトメトリー分析が、試験開始1カ月間は約2週間ごとに、52週目までは4週間ごとに、78週目までは12週間ごとに実施された。血液サンプルは、TruCount Abso lute Count チューブに入れた Becton Dickinson MultiTEST 試薬を用いて4種類の蛍光標識抗体でインキュベートし、製造元のprotocolに従って FACSCalibur で分析した。データ解析はFACSCaliburとBecton Dick inson MultiSET softwareで行った。
Clinical Definitions and Laboratory Measurements
末梢血B cell depletionの定義には、LUNAR protocolの定義（CD19＜20 cells/ml）、SLEにおけるRTXの初期の第1相試験のカットオフ値（CD19＜5 cells/ml）（16、17）、より厳格で探索的な定義（CD19数=0/ml）（以下「complete peripheral depletion」）が使用されました。ネフローゼ症候群は、baselineのAlb<3g/dl、baselineのUPCR≥3.5mg/mgと定義。RTXのピーク値は、RTX投与30分後に測定された。これらの解析では、RTXのピーク値は、投与された4回の輸液のうち達成されたRTXの全体での最高値と定義された。
Study End Points
これらの解析におけるcomplete responseは、24時間採尿によるUPCRが<0.5mg/mg、血清Crが正常、またはbaselineで正常だった場合baselineから15％増加したものと定義された。LUNAR試験のcomposite primary endpointでは、これらのUPCRとCrの項目に加え、inactive sediment（尿RBC<5/hpf）が満たされなければならなかった。今回の解析では、尿沈渣は測定のmissing dataがあった事、および尿沈渣が長期的な腎outcomeの予測因子にならないことを示す最近のデータ（24、25）から、complete responseの定義に含めないこととした。尿沈渣を含めたとしても、今回の結果に定性的な影響はなかった（Supplemental table 1）。complete responseは52週目と78週目に評価された。初回complete responseまでの時間もendpointに含めた。
Statistical Analyses
母集団におけるbaselineデータの差は、t検定、Fisherの正確検定、またはMann-Whitney U検定 を適宜用いた。事象発生までの時間の解析にKaplan-Meier生存解析を使用した。complete peripheral depletionの指標とcomplete responseの関連性を推定するために、Logistic回帰を使用した。complete peripheral depletionの達成に最も密接に関連する変数を特定するために、complete peripheral depletionをアウトカムとする単変量Logistic回帰モデルで、変数を個々に評価した。転帰と有意に関連する変数（P<0.05）のみを多変量Logistic回帰モデルに入れた。評価した変数は、complete peripheral depletionが達成された人と達成されなかった人で有意に異なるbaselineの特性、B cell depletionに重要なbaselineの単球レベル（26,27）、LNの期間、人種、RTXのピークレベル等。78週目のUPCRやCrの欠測は、7人について60日前までの値を繰り上げて代入した。解析は、STATA 14.2 soft ware（Stata Corporation, College Station, TX）を用いて行われた。両側P値<0.05を統計的に有意とした。
Results
Table 1.
Achievement of Complete Peripheral Depletion
68人全員が86日以内にCD19<20 cells/mlを、182日以内に<5 cells/mlを達成した（Supplemental figure 1、A and B）。53名（78%）の参加者が365日以内に末梢血のcomplete depletion（0 cells/ml）を達成した（Table 1）。365日後に初めて末梢血のcomplete depletionを達成した参加者はいなかった。参加者が初めてcomplete peripheral depletionを達成した内訳は、RTXの初回注入後にすぐ達成したのが8人（12％）、2回目が24人（35％）、3回目が5人（7％）、4回目が16人（24％）、達成しなかったのが15人（22％）。complete peripheral depletionを達成した参加者は，平均 eGFR（79 vs 58 ml/分，P=0.02），C3 中央値（69 vs 59 mg/dl，P=0.03）， 平均血清Alb（2.8 vs 2.1 g/dl，P<0.001 ）が有意に高く，baselineで抗Sm陽性の傾向（32% vs 7%，P=0.05），RTXの高いピーク値（456 vs 386 mg/ml，P=0.05）傾向があった．complete peripheral depletionを達成した参加者は、UPCRも低く（3.3 vs 5.2mg/mg；P=0.008）、baseline時のネフローゼ症候群も少なかった（28% vs 73%；P=0.002 ）（Table 2）。
Table 2. Comparison of baseline characteristics of patients from the LUNAR trial treated with rituximab who achieved complete peripheral depletion versus those who never achieved complete peripheral depletion
Figure 1. A larger percentage of participants from the LUNAR trial who achieved complete peripheral depletion (n = 53) achieved complete response at week 52 and at week 78, compared to participants who did not achieve peripheral depletion (n = 15).
Complete Peripheral Depletion and Achievement of Complete Response
68人の参加者は、52週目と78週目の両方の評価で完全なデータを有していた。CD19<20 cells/mlまたは<5 cells/mlの達成はcomplete responseを達成した患者を区別することができなかった（Supplemental table 2→略）。complete peripheral depletionを達成した21人（40％）が52週目に、25人（47％）が78週目にcomplete responseを示した（Figure 1）。Logistic回帰では、complete peripheral depletionの達成は、78週目のcomplete responseのオッズを増加させ（unadjusted odds ratio [OR]、5.8; 95％CI、1.2-28；P＝0.03）。参加者がcomplete peripheral depletionに留まった期間の中央値は、52週目まで64日（IQR、12～143）、78週目まで71日（IQR、14～158）であった。34人（50％）の参加者は中央値（71日）よりもcomplete peripheral depletionが長く続き、中央値よりもcomplete peripheral depletionが短い34人（50％）と比較して、78週目のcomplete responseの達成率が高かった（unadjusted OR 4.1；95％CI、1.5-11；P=0.008）（Table 3↓）。complete peripheral depletionの期間および達成度はいずれも、52週目のcomplete responseと有意に関連しなかった（Supplemental table 3）。末梢血complete depletionまでの期間とcomplete responseの達成 全参加者（n=68）において、末梢血complete depletionは中央値182日（IQR, 80-339）で達成された（Figure 2A）。complete responseを達成した被験者（n=27）では、達成までの期間中央値は170日（IQR, 109-254）であった（figure 2B）。Logistic回帰では、末梢血complete depletionの達成に30日遅れるごとに、78週目のcomplete responseの可能性は低くなった（unadjusted OR、0.89；95％CI、0.81〜0.98；P=0.02）（Table 3）。B cell depletionの遅れは、52週目のcomplete responseと有意な関連はなかった（Supplemental Table 3→略）。
Table 3.
Variables that Associate with Complete Peripheral Depletion
complete peripheral depletionと関連する変数 以下のbaseline変数は、complete peripheral depletionをアウトカムとした単変量Logistic回帰で個々に解析された：年齢、性別、eGFR、C3、C4、UPCR、Alb、単球、リンパ球、LNの期間、人種、抗Sm陽性、ネフローゼ症候群。さらに評価した変数は、RTXのピーク値。多変量Logistic回帰では、baselineのネフローゼ症候群の状態、baselineの抗Sm抗体陽性、およびRTXのピーク値は、complete peripheral depletionの達成と有意に関連していることが判明した（Table 4）。
Discussion
我々は、RTX投与後、LUNAR試験参加者はperipheral B cellの減少は多様であることを示し、減少の程度と期間が大きいほどcomplete responseと関連するという仮説を立てた。complete peripheral depletionの達成とその期間の延長、達成までの期間が短い事はすべて、78週目のcomplete responseと関連するが、52週目のcomplete responseとは関連しないことが明らかにされた。すべての参加者が、LUNAR試験protocolの定義であるB cellの減少<20 cells/ml、およびSLEにおけるRTXの初期の試験で用いられた定義 <5 cells/mlを達成した[16, 17]。したがって、これらのB細胞減少の定義は、complete responseを達成した人とそうでない人の区別に有用ではなかった。78週目の奏功を考慮すると、今回の結果は我々の仮説をほぼ支持するものであったが、complete peripheral depletionの指標と52週目のcomplete responseとの関連は見出せなかった。ＬＮで完全な効果を得るには、Ｂ cell depletionに52週以上が必要なのかもしれない。complete peripheral depletionを達成した患者では、complete response率は52週目から78週目まで上昇したが、不完全なdepletionであった患者では、complete response率は52週目から78週目まで下降した。これは、最初の免疫学的障害からの腎臓の治癒まで時間がかかることの現れと考えられる。また、マウスモデルではリンパ組織や腎尿細管間質におけるB細胞は、RTXによるＢ cell depletinに抵抗性であることが示されている[6,11-13]。Peripheral B cell depletionは、B細胞がリンパ系組織に移動するのを阻止することにより、標的組織におけるB細胞の負荷を減少させると考えられている[8]。このプロセスは、腎臓のin situのB細胞および形質細胞の数をcomplete responseに必要な程度まで低下させるために、比較的長い時間を必要とする場合がある。peripheral depletionが不完全な場合、B細胞はより迅速にこれらのリンパ組織に再増殖し、78週目に観察されたcomplete responseの減少の原因となっている可能性がある。complete peripheral depletionの達成は明らかに有益であるにもかかわらず、complete peripheral depletionを達成した被験者の半数以下しかcomplete responseを達成できなかった。自己反応性病原性B細胞は、末梢のB細胞を十分に除去しても、リンパ系構造、腎尿細管間質、骨髄などの保護された微小環境に残存している可能性がある[6,11-13]。これらの細胞はルーチンに測定することができないので、腎臓の傷害を継続させる自己免疫活性を継続させるかもしれない[4,5]。また、BAFFの大幅な増加など、RTXの意図しない作用があり、自己反応性B細胞の生存を促進し、RTXの効果を制限する可能性がある[28]この仮説は現在、Synergetic B-cell Immodulation in SLE (Clinicaltrials.gov identifier NCT 02284984, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02284984?term=02284984&draw=2&rank=1)で検証されている。この試験は、RTXに続いてBAFF阻害剤であるベリムマブを投与する概念を実証した研究。LUNAR試験では、生検を繰り返し行う必要がなかったため、炎症が継続していることが蛋白尿の継続の原因であるかどうかは、断定できない。SLEのB細胞減少を促進する治療薬は、参加者全体のB細胞減少プロファイルをより均質にし、LNに対する有効性を高める可能性がある。Obinutuzumabは最近開発されたCD20に対するII型mAbで、RTXと比較して、nonapoptotic B cell–killing mechanismとantibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)活性が改善された[29-32]。Obinutuzumabは、慢性リンパ性白血病において、RTXよりも末梢血やリンパ組織で大きなB細胞減少をもたらすことが示さている[32]。リンパ節におけるB cell depletionが増加することから、Obinutuzumabは腎臓のin situにおいてもBcell depletionの増加を達成できる可能性がある。
The Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Obinutuzumab Compared With Placebo in Participants With Lupus Nephritisは、増殖性LN患者を対象に、Obinutuzumabまたはplaceboとミコフェノール酸およびステロイドのバックグラウンド療法のいずれかに無作為に割り付ける第II相試験（Clinicaltrials.gov ID NCT01905943）で、B cell depletionが大きくなると反応率が高まるという仮説の検証を目指して行われている試験である。
多変量Logistic回帰モデルにより、発症時にネフローゼ症候群がないこと、RTXのピーク値が高いことが、末梢血complete depletionと関連することが示唆された。SLE患者は、RA患者と比較して、達成できるRTXレベルが有意に低い。これは、蛋白尿のないSLE患者でも同様であり、RTXの内在化が進み、Igの異化が進んだためと考えられる[33]。さらに、膜性腎症によるネフローゼ症候群の患者におけるRTXのt1/2は、RAと比べ有意に減少している[34,35]。RTXで治療されたネフローゼ症候群の患者は、ネフローゼ症候群を引き起こした元の診断に関係なく、RTXの尿中濃度が高いことが分かっている[36,37]。膜性腎症では、375mg/m2を毎週4回投与するRTXレジメンは、1gを15日間隔で2回投与した場合と比較して、より長期間にわたって高いRTX濃度が得られ、B cell depletionが改善した[34,35]。これらの知見はLN患者、特にネフローゼ症候群を併発した患者が、より深い末梢血B cell depletionを達成するためには、RTXをより長期間投与する必要があり、その結果、RTXの効果がより高まる可能性があることを示唆している。LUNAR試験で観察されたピーク値のばらつきを理解し、それがネフローゼ症候群と関連しているかどうかを調べるには、より詳細な薬物動態試験が必要である。またbaselineの抗Sm抗体陽性は、complete peripheral depletionと関連していた。抗SmはSLEで最も特異的な抗体であり、より重篤な症状や予後不良と関連している[38-40]。なぜこのような関係が見出されたのかは不明であるが、もし後続の研究でもこの関係が再現されるのであれば、さらなる調査が必要であると思われる。
本研究の限界はRCTのpost hoc解析であり、多重検定の統計的補正が行われていないことだ。この試験に使用されたflow-cytometoryは、閾値が ＜5 cells/mlにおける妥当性は内的に検証されておらず、この<5では精度が低い可能性がある。フォローアップの期間は78週目までとされた。重要なことは、RTXはLNに使用することは承認されていないことである。要約すると、本研究は、LNにおけるRTX投与後の末梢血B cell depletionにはばらつきがあり、peripheral depletionの程度と期間が大きくなれば、またcomplete peripheral depletionまでの期間が短いと、78週目のcomplete responseに関連するという仮説を支持するものである。
結論として、RTXとミコフェノール酸の併用療法は、従来のflow-cytometoryによる最も厳格なB cell depletionの定義では、一様なB cell depletionを達成することができず、このことがLUNAR試験で認められた効果の低さに寄与している可能性がある。我々は、末梢血のB cell depletionを強化することで、LNのB cell depletionの薬剤を用いることで転帰が改善される可能性があると仮定する。これは、RTXとベリムマブなどの他の薬剤との併用、RTXの薬物動態の深い理解による代替投与法の開発、またはObinutuzumabなどの新しい治療法の使用によって達成できる可能性がある。
＜リウマトロジストのコメント＞
勉強になったことは、以下の3点です。
- incompleteなB cell depletion (CD19<5) ではCRを予測できない。complete depletion (CD19=0) の達成をもってしても52週目のCRを予測できず、78週目になってやっと予測できる。
- complete depletion (CD19=0)を達成しても短期間ではだめで(CR 30%)、71日以上を達成すればCR 70%を得ることができる。
- complete depletion (CD19=0)に関連する臨床的な因子は多変量解析で、ネフローゼ (OR 0.12)、抗Sm抗体 (OR 13.8) のみ。
今日も論文に感謝。
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